» » ДНК-микроскопия

ДНК-микроскопия

ДНК-микроскопия

Это изображение смешанной культуры клеток, в которой одни клетки экспрессируют зеленый флуоресцентный белок, а другие — красный, получено без применения микроскопа. Пространственное положение отдельных клеток определялось с помощью секвенирования нуклеотидных последовательностей. Новый метод получил название ДНК-микроскопия.

Микроскоп — ключевой инструмент для анализа пространственной организации клеток — давно стал символом биологии. Но недавно удалось реконструировать изображения эукариотических клеток, обойдясь вообще без микроскопа. Вместо этого ученые использовали возможности современного высокопроизводительного секвенирования — определения последовательности нуклеотидов сразу в огромном количестве цепочек ДНК. Им удалось «записать» информацию о взаимном расположении молекул матричных РНК (мРНК) этих клеток в последовательности ДНК, а затем, прочитав последовательности этих ДНК, расшифровать исходную информацию о положении клеток в пространстве.

Моделью для исследования послужила культура клеток аденокарциномы молочной железы человека. Первым делом клетки зафиксировали раствором формальдегида: формальдегид индуцирует образование кросс-сшивок (см. Cross-link) между макромолекулами и предотвращает их диффузию. В таком препарате клетки и содержащиеся в них макромолекулы сохраняли свое исходное взаимное расположение.

В качестве объекта для наблюдения были выбраны не ДНК, а мРНК. Такой выбор был связан с тем, что мРНК занимает почти весь объем клетки, а ДНК содержится только в ядре и митохондриях. (Для удобства из всех типов мРНК, содержащихся в клетке, были выбраны четыре мРНК, концентрация которых в клетке высока.) Ученые провели обратную транскрипцию и на основе мРНК получили двуцепочечную комплементарную ДНК (кДНК). Чтобы поставить обратную транскрипцию, ученые использовали праймеры (короткие фрагменты нуклеиновой кислоты, служащие в качестве затравки для синтеза цепи), сконструированные особым образом. Каждый праймер состоял из двух частей — детерминированной последовательности нуклеотидов, нужной для старта реакции обратной транскрипции, и вариабельной последовательности нуклеотидов, уникальной для каждого праймера. Таким образом, каждая отдельная молекула кДНК не только содержала информацию об исходной последовательности мРНК, но и получила свой уникальный «штрихкод» (Unique molecular identifier, UMI).


ДНК-микроскопия

Добавление специальных меток (штрихкодов) к комплементарной ДНК с помощью реакции обратной транскрипции. Для этого использовали специальные праймеры, содержащие вариабельную (выделена зеленым или синим), а также детерминированную последовательность нуклеотидов (остальной участок праймера, который нужен для старта реакции обратной транскрипции). сDNA — комплементарная ДНК, mRNA — матричная РНК, UMI — штрихкод. Рисунок из статьи J. A. Weinstein, 2019. DNA Microscopy: Optics-free Spatio-genetic Imaging by a Stand-Alone Chemical Reaction


После этого полученную кДНК амплифицировали (делали копии) с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Положение исходных мРНК было зафиксировано в препарате, однако копии кДНК уже имели возможность диффундировать от этой точки в пространстве. Фактически, в данном препарате происходило два процесса — образование новых копий кДНК и их постепенная диффузия от своего изначального местоположения. Таким образом формировались пространственные градиенты концентраций молекул кДНК с уникальными UMI с максимумом концентрации в точке положения уникальной молекулы мРНК. Авторы метода подобрали такие условия, чтобы получившиеся молекулы кДНК с уникальными штрихкодами могли последовательно соединяться друг с другом, если оказались рядом.


ДНК-микроскопия

Амплификация кДНК с помощью полимеразной цепной реакции. В результате этой реакции оказавшиеся рядом молекулы кДНК с разными штрихкодами могут оказаться сшиты в одну цепочку ДНК, содержащую сразу два «штрихкода» (UMI). Образование каждой пары последовательно сшитых ДНК приводит к образованию из ОЕ (overlapping event) участков праймеров еще одного уникального ДНК штрихкода — UEI (unique event identifier). Рисунок из статьи J. A. Weinstein, 2019. DNA Microscopy: Optics-free Spatio-genetic Imaging by a Stand-Alone Chemical Reaction


В результате получались молекулы ДНК, содержащие штрихкоды (UMI) сразу от двух разных молекул кДНК. При этом шансы оказаться сшитыми последовательно друг с другом были больше у молекул кДНК, расположенных близко друг к другу в пространстве. Таким образом, чем ближе были молекулы кДНК (а следовательно, и исходные молекулы мРНК), тем больше «сдвоенных» молекул получалось в результате поставленных реакций. Полученную смесь молекул собирали в одну общую пробирку — на этом этапе вся пространственная информация уже была записана в ДНК. Далее ученые секвенировали полученные ДНК и рассчитывали относительное число каждой пары штрихкодов (UMI). На основании этой информации реконструировали наиболее вероятное исходное положение клеток с помощью специально разработанного математического подхода.


ДНК-микроскопия

Общая схема дизайна эксперимента по определению взаимного расположения молекул РНК. Полученные на их основе молекулы кДНК (обозначены короткими стрелками) оказались помечены шестью различными штрих кодами (UMI1UMI6). На следующем этапе были получены попарно сшитые молекулы кДНК, содержащие пары UMI (обозначены длинными стрелками). Чем ближе располагались исходные молекулы РНК, тем больше образовалось соответствующих сдвоенных молекул ДНК с разными UMI. Число таких сдвоенных молекул ДНК (содержащих два разных UMI) отражает пространственную близость молекул РНК с соответствующими UMI. Изображение из статьи J. A. Weinstein, 2019. DNA Microscopy: Optics-free Spatio-genetic Imaging by a Stand-Alone Chemical Reaction


Чтобы продемонстрировать, что метод работает, ученые смешали две культуры клеток. Одна культура клеток экспрессировала красный флуоресцентный белок, а другая — зеленый. Использование флуоресцентных белков позволяло следить за клетками традиционными методами флуоресцентной микроскопии.


ДНК-микроскопия

Сопоставление данных, полученных с помощью флуоресцентной микроскопии и с помощью ДНК-микроскопии. B — смешанная культура клеток в оптическом микроскопе. Часть клеток экспрессирует красный флуоресцентный белок (RFP), другая часть — зеленый флуоресцентный белок (GFP). Длина масштабного отрезка: 100 мкм. D — реконструированное изображение клеток того же самого препарата, проанализированного методом ДНК-микроскопии. Несмотря на то что на реконструированном изображении не удается проследить границы отдельных клеток, из рисунка видно, что общая картина взаиморасположения клеток, полученная двумя разными способами, имеет схожие очертания. Изображение из статьи J. A. Weinstein, 2019. DNA Microscopy: Optics-free Spatio-genetic Imaging by a Stand-Alone Chemical Reaction


Для данной смеси культур клеток разработанный метод ДНК-микроскопии позволил получить изображение сразу от четырех разных источников — матричных РНК, кодирующих белок актин (ACTB), фермент глицеральдегид-фосфат дегидрогеназу (GAPDH), зеленый и красный флуоресцентные белки. Актин и глицеральдегид-фосфат дегидрогеназа — жизненно-необходимые белки, и их мРНК присутствуют во всех клетках. В то же время мРНК зеленого флуоресцентного белка содержалась только в одной, а мРНК красного — только в другой культуре клеток. Полученное изображение показывает, что реконструированные сигналы (предсказанное положение в пространстве, которое отображается интенсивностью цвета на рисунке) от флуоресцентных белков пространственно совпадают с сигналами от актина и GAPDH, но расходятся друг с другом. Это значит, что метод позволяет различить отдельные клетки.


ДНК-микроскопия

Реконструированное изображение (предсказанное положение в пространстве) для четырех типов матричных РНК: актина (ACTB), гликолитического фермента глицеральдегид-фосфат дегидрогеназы (GAPDH), зеленого флуоресцентного белка (GFP) и красного флуоресцентного белка (RFP) в смешанной культуре клеток. Это изображение получено методом ДНК-микроскопии без применения оптического микроскопа. Вверху — изображения, построенные для каждого типа мРНК по отдельности; внизу — наложение всех четырех изображений. При наложении использовались псевдоцвета для обозначения предсказанного положения мРНК GFP и RFP. Изображение из статьи J. A. Weinstein, 2019. DNA Microscopy: Optics-free Spatio-genetic Imaging by a Stand-Alone Chemical Reaction


С помощью ДНК-микроскопии на данный момент удалось разрешить лишь отдельные клетки (причем две плотно прилегающие друг к другу клетки различить невозможно), но не внутреннюю организацию клетки. Таким разрешением сейчас никого не удивишь: современными методами флуоресцентной микроскопии можно определять внутриклеточное положение отдельных молекул и наблюдать за ними (см. видео). Поэтому ДНК-микроскопия пока что представляет собой лишь доказательство принципа, что такой подход вообще возможен.

Однако у такого подхода есть и потенциальные преимущества. Стандартные методы флуоресцентной микроскопии позволяют наблюдать одновременно за двумя-тремя, редко больше восьми, разными типами объектов. Для этого используют флуоресцентные белки и флуоресцентные зонды с различающимся спектром, которые можно отличить, подобрав на микроскопе соответствующий набор цветовых фильтров (например, есть метод флуоресцентной гибридизации in situ, адаптированный для различения восьми разных микроорганизмов). Однако использование одновременно большого количества флуорофоров затруднено, так как при увеличении их числа становится всё труднее отличать их друг от друга. В то же время ДНК-микроскопия в перспективе может дать информацию о пространственном положении одновременно тысяч разных РНК — этот подход не зависит от оптических систем и, следовательно, не имеет таких ограничений.

Изображение из статьи J. A. Weinstein, 2019. DNA Microscopy: Optics-free Spatio-genetic Imaging by a Stand-Alone Chemical Reaction.

Дмитрий Кнорре

10 сентябрь 2020 /
  • Не нравится
  • +1
  • Нравится

Похожие новости

Родственные интернейроны у эмбрионов мышей расселяются по переднему мозгу независимо друг от друга

Как развитие мозга у зародыша влияет на работу этого органа в будущем? Что важнее для расселения новообразованных нейронов по головному мозгу — их эмбриональное происхождение или влияние окружающих

Разработан метод пространственной визуализации транскрипции генов

Группа ученых из Швеции разработала новый метод получения и визуализации транскриптомных данных прямо на гистологических срезах, причем с учетом пространственного параметра. Подход позволяет

Нервные клетки обмениваются РНК, упакованной в похожую на капсид ВИЧ оболочку

Активность гена Arc в нервных клетках млекопитающих критически важна для запоминания новой информации, но до сих пор о функциях белка Arc было известно крайне мало. Новое исследование показало, что

Конусы роста аксонов

На этой микрофотографии видны длинные отростки (аксоны) ганглионарных клеток сетчатки, выращенных из стволовых клеток человека...

ДНК-кометы

Перед вами — необычные «кометы»: каждая комета — это ДНК отдельной клетки, и чем больше повреждений в этой ДНК, тем больше у кометы хвост...
Комментарии

НАПИСАТЬ КОММЕНТАРИЙ

Ваше Имя:
Ваш E-Mail:
Код:
Кликните на изображение чтобы обновить код, если он неразборчив
Введите код:
Популярные новости
Триасовый ихтиозавр Guizhouichthyosaurus оказался сверххищникомИстория робототехники: как выглядели самые первые роботы?Почему наша Вселенная такая странная и существуют ли законы физики?Чипирование началось: Neuralink проследила за мозговой активностью свиньиВ Японии испытали "летающий автомобиль"Голографическое кино может стать реальностью1 сентября к Земле приблизится астероид размером с многоэтажный домНа каких самолетах летают президенты США и России?