» » Биспецифичные антитела помогают Т-клеткам распознавать раковые клетки по точечным мутациям

Биспецифичные антитела помогают Т-клеткам распознавать раковые клетки по точечным мутациям


Биспецифичные антитела помогают Т-клеткам распознавать раковые клетки по точечным мутациям

Рис. 1. Схема получения синтетических антител. Иммуноглобулины G (IgG) — самый распространенный тип антител в организме человека. У каждой молекулы IgG есть два идентичных участка (показаны зеленым и красным), которыми она может «поймать» антиген, против которого рассчитана, — отсюда и подпись bivalent monospecific. Их можно определить и превратить в самостоятельные молекулы (scFv, single chain variable fragments). Сшив такие участки между собой (ScDb, single chain diabody), можно сконструировать синтетическое антитело, которое будет узнавать сразу два разных антигена (scDb-Fc, буквы «Fc» означают Fragment crystallizable region — кристаллизующийся фрагмент иммуноглобулина, это «ножка» антитела). При помощи таких биспецифичных антител можно, например, связывать между собой клетки опухоли и иммунной системы. Схема подготовлена на основе рисунка с сайта izi.uni-stuttgart.de


Исследователям из университета Джонса Хопкинса удалось опознать и обезвредить раковые клетки по их специфичным внутренним белкам, отличающимся от нормальных белков заменой всего одной аминокислоты. Это было сделано при помощи иммунотерапии биспецифичными антителами, которые четко узнавали эти клетки со сломанным белком p53 и призывали к ним Т-киллеров. При этом здоровые клетки с обычным вариантом этого белка, которых в организме гораздо больше, полностью игнорировались. Пока этот подход опробован только in vitro и на мышах, но в будущем он может серьезно продвинуть лечение раков с поломками в белке p53.

Иммунотерапия позволяет организму бороться со злокачественной опухолью его же Т-клетками, переобученными в лаборатории на распознавание и уничтожение новообразования. Задача по поиску идентификаторов для иммунной системы, на основании которых она будет принимать решение о том, злокачественная клетка или нет, ложится в этом случае на плечи ученых. На эту роль замечательно подходят неоантигены, — специфичные для опухоли мутантные белки, которых нет в клетках здоровых тканей организма. Чуть хуже подходят белки, которые часто встречаются в опухолевых клетках и редко — в здоровых: если иммунная система будет уничтожать все клетки с таким белком, то пострадают и полезные клетки. Тем не менее, именно такие белки и составляют большинство хорошо изученных мишеней для иммунотерапии. Примером может служить белок CD19, который в изобилии есть на поверхности клеток лимфомы и нормальных B-клеток. В ходе иммунотерапии Т-клетки нападают на все клетки, несущие на себе этот белок, но затем популяция нормальных клеток восстанавливается за счет созревания новых.

Неоантигены — гораздо более сложная цель. Во-первых, переобученные иммунные клетки должны хорошо отличать мутантные белки от обычных. Это не всегда просто, ведь порой они отличаются всего на одну аминокислоту. Во-вторых, клетка должна вырабатывать этот мутантный белок в изобилии и, главное, демонстрировать его иммунной системе. Напрямую она видит только белки расположенные на поверхности клетки, а доступ ко внутреннему содержимому осуществляется через главный комплекс гистосовместимости (ГКГС или MHC — от major histocompatibility complex). На этой структуре, расположенной на мембране всех ядерных клеток организма, иммунной системе демонстрируются кусочки белков клетки.

Разные пептиды взаимодействуют с ГКГС с разной охотой, и для поимки опухолевой клетки по неоантигену нужно, чтобы его кусочек с мутацией активно выставлялся на ГКГС. Количество неоантигена в клетке тоже играет свою роль — чем его больше, тем больше шансов, что он будет узнан иммунной системой.

Таким образом, одни из самых сложных для поимки неоантигенов — это внутренние белки клетки с точечными мутациями и умеренным уровнем экспрессии. Тем не менее, как показывают две новые работы, выполненные в лаборатории Шибина Чжоу (Shibin Zhou) из онкологического центра Сидни Киммела Университета Джонса Хопкинса, эта задача выполнима.

Чжоу с коллегами провели эксперименты с двумя разными неоантигенами, при этом суть обеих работ очень близка. В первой статье, опубликованной в журнале Science, они описали, как включить иммунный ответ так, чтобы он уничтожил клетки с мутантным белком p53. Вторую работу (опубликованную в тот же день в журнале Science Immunology) посвятили клеткам с мутантными белками семейства RAS.

Белок p53 как раз относится к сложным неоантигенам. Это ключевой онкосупрессор, который активен в нормальных клетках, а его выключение и/или неспособность выполнять свою работу приводят к неконтролируемому делению клеток. Хотя поломки в гене TP53, кодирующем этот белок, встречаются в большинстве раков, целевого лечения до сих пор нет.

В опухолевых клетках этот ген работает плохо, так что на их ГКГС, где он может быть узнан иммунной системой или иммунотерапевтическими препаратами, белка p53 не больше, чем на обычных клетках. Можно попытаться отличать опухолевые клетки по мутациям в p53, но это необходимо делать очень аккуратно — здоровых клеток с обычным p53 много, и ошибочное признание этих клеток раковыми может дорого стоить организму.

Типичные раковые мутации в гене TP53 — это одиночные замены в участке, кодирующем ДНК-связывающий домен белка. Самая распространенная такая мутация (и самая распространенная мутация в онкосупрессорах вообще) — R175H, замена аргинина (R) на гистидин (H) в 175 позиции белка. Именно ее исследователи и выбрали в качестве своей цели.

RAS — это целое семейство протоонкогенов. С поломками входящего в него, например, гена KRAS связано примерно 20% всех раков и лишь недавно для него удалось подобрать удачный вариант таргетной терапии (см. новость «Неподдающийся» онкоген KRAS сдает позиции, «Элементы», 09.06.2020). В случае мутаций количество соответствующего белка внутри клеток вырастает, но из-за того, что на поверхности клетки он появляется только на ГКГС и порезанным на кусочки, поймать его при помощи иммунотерапии до настоящего момента не получалось. Исследователи попробовали научить иммунную систему распознавать при помощи биспецифичных антител две самые распространенные мутации, которые могут быть у трех генов семейства RAS: G12V (замена глицина на валин в 12 позиции) и Q61H/L/R (замена глутамина на гистидин, лейцин или аргинин в 61 позиции).

Обе работы выстроены по одному принципу: исследователи нашли нужный антиген, разработали антитела, проверили их эффективность in vitro и in vivo на мышах, а также удостоверились в их специфичности.



Как работают биспецифичные антитела

На клеточном уровне в организме основные борцы с раковыми клетками — это Т-киллеры. Стандартная последовательность событий при иммунном ответе выглядит следующим образом:

  • Характерный для опухолевой клетки белок разрезается на кусочки (как и другие белки) и выставляется в составе комплекса ГКГС (главный комплекс гистосовместимости) на поверхности клетки;
  • Т-киллеры при помощи молекул TCR (T-клеточный рецептор) проверяют содержимое ГКГС других клеток;
  • Рецепторы TCR у Т-киллеров разные, и только в случае, если рецептор идеально подошел к содержимому ГКГС (как ключ к замку), он передает сигнал об этом на расположенный рядом рецептор CD3;
  • CD3 передает сигнал внутрь клетки и запускает активацию Т-киллера;
  • это приводит к выбросу перфоринов и гранзимов, они делают дырки в мембране больной клетки, отравляют ее и клетка погибает.

Биспецифичные антитела работают как переходники между молекулами антигена на поверхности раковой клетки и Т-клеточным белком CD3. В отличие от обычных антител они могут узнавать не одну, а сразу две или даже три цели и связывать их. Одним из своих хвостов биспецифичное антитело цепляется к антигену раковой клетки, а другим — к рецептору CD3 иммунной клетки. Это активирует Т-клетку: она выбрасывает гранзимы и перфорины, которые портят мембрану раковой клетки, и та погибает.

При этом антигенные «предпочтения» Т-киллера не играют никакой роли: активация идет в обход его TCR. Это существенно увеличивает количество потенциальных убийц для опухолевой клетки.

Кроме того, биспецифичные антитела могут находить молекулы неоантигенов не только в комплексе с ГКГС, но вообще везде на поверхности клеток. Для детекции раковой клетки по ее внутренним белкам это не принципиально — они все равно появляются только на ГКГС, но для поиска по поверхностным структурам это существенно увеличивает количество доступных мишеней.


Биспецифичные антитела помогают Т-клеткам распознавать раковые клетки по точечным мутациям

Механизм работы биспецифичного антитела при охоте на клетку с мутантным белком p53. Связываясь одним концом с мутантным кусочком p53 на ГКГС клетки, а другим — с рецептором CD3 Т-клетки, антитело активирует Т-клетку. Рисунок из обсуждаемой статьи в Science



По данным исследователей кусочек белка p53 с нужной мутацией, HMTEVVRHC (цветом отмечено место мутации), может выставляться в качестве эпитопа на поверхности клетки в составе одного из распространенных вариантов ГКГС (аллель A*02:01), а значит, он может быть найден там биспецифичными антителами.

В качестве основы для антиген-распознающей половинки препарата ученые взяли антитела, мимикрирующие под настоящий Т-клеточный рецептор: они тоже узнают пептиды в комплексе с ГКГС, но связываются с ним прочнее. При помощи фагового дисплея исследователи проверили огромное количество таких антител на их способность узнавать комплекс ГКГС:HMTEVVRHC и получили два подходящих варианта, отличающихся по способности связываться с нормальным вариантом белка p53 (ГКГС:HMTEVVRRC). Поскольку от антитела требовалась максимальная специфичность, для дальнейшей разработки был выбран тот вариант, который совсем не связывался с обычным p53 даже в высоких концентрациях.

Определившись с антиген-специфичной половинкой препарата, исследователи сшили ее со второй частью, активирующей Т-киллера. Есть несколько общеупотребительных вариантов этих деталек, исследователи проверили их и выбрали самый эффективный.

Работоспособность конструкции исследователи проверили in vitro и in vivo, на мышах. Ученые выбрали десять клеточных линий, которые отличались по присутствию и отсутствию замены R175H и по активности нужного аллеля ГКГС. При культивации антител и Т-клеток они ожидали увидеть дозозависимую активацию Т-клеток в тех линиях, клетки которых имели мутацию. В целом так и было (рис. 2), причем T-клетки активировались даже при следовых концентрациях антител.


Биспецифичные антитела помогают Т-клеткам распознавать раковые клетки по точечным мутациям

Биспецифичные антитела помогают Т-клеткам распознавать раковые клетки по точечным мутациям

Рис. 2. B — активность Т-клеток в зависимости от количества биспецифичных антител и характеристик линий клеток. Активность Т-клеток наблюдалась только в линиях с мутацией в белке p53 и с высоким и средним уровнем ГКГС, а также зависела от количеств антител. С — при культивации вместе с линией KMS26 и при росте концентрации антител у Т-клеток меняется не только уровень IFN-?, но и другие связанные с активацией параметры. D — последовательные фотографии окрашенных флуоресцентным зеленым белком клеток линии TYK-nu, культивировавшихся вместе с Т-клетками в присутствии (справа) и в отсутствии (слева) биспецифичных антител. Рисунок из обсуждаемой статьи в Science


Аналогичные наблюдения авторы работы получили и в экспериментах, в которых они сравнили пары из обычных клеточных линий и тех же линий с измененной активностью генов ГКГС/обычного/мутантного p53.

Важным для активации Т-клеток фактором закономерно оказалось количество белковых комплексов ГКГС на поверхности клеток: чем их больше, тем больше на них попадало мутантных пептидов и тем лучше шла активация клеток. Это наблюдение может сыграть важную роль на практике, ведь спрятать ГКГС — это распространенная тактика, благодаря которой раковые клети приобретают устойчивость против иммунной системы.

Проверка биспецифичных антител на мышах, которым предварительно вкололи опухолевые клетки (с мутантным p53) и человеческие Т-клетки, тоже дала положительные результаты. Опухоли у мышей, пролеченных биспецифичными антителами, практически исчезли, тогда как в контрольных группах их рост продолжался в течение всего эксперимента.

Чтобы понять причины, по которым антитело получилось таким специфичным, ученые определили третичную структуру центрального участка комплекса «антитело — мутантный p53 — ГКГС», на котором происходит взаимодействие трех молекул. Выяснилось, что мутантная и соседняя с ней аминокислоты играют важную роль в узнавании пептида антителом: именно с ними у антитела формируется больше всего контактов. Кроме того, исследователи последовательно мутировали каждую из аминокислот пептида и экспериментально проверили способность этих пептидов связываться с антителами и активировать Т-клетки. Выяснилось, что первая аминокислота у этого пептида может оказаться практически любой (рис. 3).


Биспецифичные антитела помогают Т-клеткам распознавать раковые клетки по точечным мутациям

Рис. 3. Активация Т-клеток пептидами, отличающимися на одну аминокислоту от исходного мутантного варианта. Чем больше IFN- ?, тем сильнее активация Т-клеток и тем лучше связывание антитела с пептидом. Видно, что первая аминокислота пептида может быть практически любой и слабо влияет на активацию Т-клеток, тогда как другие аминокислоты — особенно исходно мутантная восьмая — очень важны и почти любая их замена снижает эффективность Т-клеточного ответа. Рисунок из обсуждаемой статьи в Science


In vitro результаты по белкам RAS тоже получились удачными: разработанные антитела видели те небольшие количества мутантных пептидов, которые попадали в ГКГС и наоборот, игнорировали клетки с нормальными белками RAS. В экспериментах на мышах антитела, хоть и не устраняли опухоли полностью, но замедляли их рост.

Обсуждаемые работы — вне зависимости от того, насколько исследованные в них антитела окажется возможным использовать на практике, — продемонстрировали целый ряд важных моментов. Впервые была показана возможность иммунотерапии для ключевых внутриклеточных неоантигенов, p53 и RAS. Их мутантные кусочки попадают на поверхность клетки в очень небольших количествах, но несмотря на это их удалось обнаружить при помощи биспецифичных антител и вызвать иммунный ответ. И хотя эти целевые пептиды отличаются от нормальных всего на одну аминокислоту, этого достаточно, чтобы антитела не путали их между собой. Разумеется, до применения таких биспецифичных антител в медицинской практике еще очень далеко, первый шаг к этому уже сделан.

Источники:
1) Emily Han-Chung Hsiue et al. Targeting a neoantigen derived from a common TP53 mutation // Science. 2021. DOI: 10.1126/science.abc8697.
2) Jacqueline Douglass et al. Bispecific antibodies targeting mutant RAS neoantigens // Science Immunology. 2021. DOI: 10.1126/sciimmunol.abd5515.

Вера Мухина


21 март 2021 /
  • Не нравится
  • 0
  • Нравится

Похожие новости

Коронавирусные тромбы появляются из-за аутоиммунных антител

Аутоиммунные антитела, появляющиеся при инфекции, провоцируют иммунные клетки закупоривать кровеносные сосуды.

Ученые нашли в кишечнике спусковой механизм аллергии на арахис

Американские исследователи выяснили, откуда берутся клетки, которые запускают аллергическую реакцию на арахис

Т-клетка с химерным антигенным рецептором (CAR-T)

На этой иллюстрации показана борьба модифицированного Т-киллера с опухолью в ходе иммунотерапии острого лимфобластного лейкоза — CAR-T-терапии...

Т-клетки здоровых людей научили распознавать чужой рак

Один из перспективных подходов к лечению рака — применение Т-клеток, реагирующих на новые антигены, которые возникают вследствие мутаций в генах опухолей. Проблема в том, что лишь малая доля этих

Антитела к тромбоцитам

Как известно, кровь состоит из различных типов клеток. Важную роль в нормальном функционировании организма выполняют не только красные и белые клетки крови, которые «на слуху» (эритроциты
Комментарии

НАПИСАТЬ КОММЕНТАРИЙ

Ваше Имя:
Ваш E-Mail:
Код:
Кликните на изображение чтобы обновить код, если он неразборчив
Введите код:
Популярные новости
Замечательная история о том, почему наследник британского престола носит титул принца Уэльского5 ситуаций, когда кнопочный телефон лучше смартфонаКакое самое плохое решение в истории было принято человеком?Сколько всего опасных динозавров жило на Земле за всю историю?В Австралии найдена самая тяжелая бабочка с огромными крыльямиЧем занять детей в период коронавируса?Все про жесткость ортопедического матрасаКак выбрать качественный матрас для комфортного сна