» » Разноцветные дрожжи

Разноцветные дрожжи


Разноцветные дрожжи

На этой микрофотографии вы видите клетки пекарских дрожжей (Saccharomyces cerevisiae), помеченные флюоресцентными красителями в соответствии с тем, к какому штамму (то есть чистой культуре с определенным генотипом) они принадлежат. Каждое колечко — окрашенная клеточная стенка одной клетки. Это очень тонкий срез фиксированной культуры дрожжей, приготовленный для электронной микроскопии. Но до того, как изучать этот образец при помощи электронного микроскопа (ЭМ), его сфотографировали на флюоресцентный микроскоп (ФМ) и получили это симпатичное изображение.

Пекарские дрожжи — это одноклеточные грибы из отдела аскомицетов. Кроме того что это важнейший организм для производства выпечки и алкогольных напитков, пекарские дрожжи — одни из простейших и наиболее изученных эукариот. В клетке дрожжей есть все те же самые органеллы, транспортные пути и системы контроля качества (например, шапероны, см. картинку дня Бактериальный шаперонин GroE), что и в наших клетках. То есть многие базовые клеточные процессы, не связанные с многоклеточностью, можно изучать и в клетках дрожжей. А вот делать это гораздо легче, чем в клетках млекопитающих.

Изучяя функцию гена, в качестве первого шага обычно удаляют этот ген из генома и смотрят на тот или иной процесс или же добавляют к нему ген зеленого флюоресцентного белка (GFP), чтобы определить, где находится белковый продукт. Такое редактирование генома всегда основано на гомологичной рекомбинации — способности клетки заменить кусочек своего генома на другой кусок ДНК с похожей последовательностью. Например, чтобы добавить к гену GFP, надо доставить внутрь клетки молекулу ДНК с геном GFP, окруженным такими же нуклеотидными последовательностями, как и в месте генома, где должна произойти вставка. Клетки млекопитающих не могут инициировать рекомбинацию просто так: место вставки сначала нужно повредить. Для этого нужны система CRISPR/Cas9 и другие, более старые, технологии, такие как TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nuclease), которые раньше использовали для млекопитающих. Даже с CRISPR редактирование генома клеток млекопитающих может занять несколько месяцев.

C дрожжами ситуация значительно лучше: они могут инициировать рекомбинацию без дополнительной помощи. Поэтому отредактировать геном в дрожжах можно за несколько дней. Этим свойством ученые успешно пользуются уже около 30 лет. Кроме того, дрожжи, в отличие от клеток млекопитающих, быстро растут и могут синтезировать большинство необходимых веществ самостоятельно, поэтому не требуют дорогих сред и стерильных боксов для работы с ними. Параллельно можно получить десятки и сотни разных штаммов дрожжей. Поэтому изучение функций генов дрожжей имеет невиданные масштабы: за несколько дней можно изучить влияние всех генов дрожжей на тот или иной процесс. Для этого были созданы целые коллекции мутантных штаммов, в каждом из которых точно и систематически удален или модифицирован определенный ген (из всего 6000). Такие коллекции несложно изучить целиком при помощи ФМ. Живые дрожжи сажают в многолуночные планшеты, а автоматический микроскоп снимает их.


Разноцветные дрожжи

Разноцветные дрожжи

Клетки дрожжей, помеченные флюоресцентными метками, снятые с помощью флюоресцентного микроскопа. Фото © Юрий Быков


Но не все процессы легко изучать при помощи ФМ. В некоторых случаях лучше подходит электронная микроскопия. Данные ФМ и ЭМ во многом комплементарны. ФМ может работать с живыми клетками и очень специфично показывает только объекты, помеченные флюоресцентными метками, при относительно небольшом увеличении. ЭМ неспецифично показывает все клеточные структуры одновременно и при гораздо большем увеличении, не превзойденном даже ФМ сверхвысокого разрешения. Это возможно потому, что вместо света в ЭМ используются электроны, не имеющие ограничения по длине волны (для биологических объектов).

Но поскольку электроны свободно распространяются только в вакууме и хорошо проходят только через образцы тоньше микрона, работать с живыми клетками в ЭМ нельзя. Их приходится фиксировать (то есть убивать при помощи заморозки или сшивания всех биомолекул друг с другом химическими способами), замещать воду на специальный пластик (это называется проводка) и резать на очень тонкие срезы. Если мы хотим изучить множество штаммов, то для каждого из них все это придется делать по отдельности. Проводку можно сделать автоматически для небольшого количества образцов, а вот резка — тонкая и очень напряженная ручная работа. Изучить тысячи и даже сотни штаммов так не получится. Поэтому ЭМ в плане производительности сильно отстает от обычной ФМ и даже от самого производства мутантных дрожжей. Например, сделать сто новых штаммов можно за месяц. Их изучение с помощью ФМ займет примерно полчаса, а вот сделать из них и изучить сто образцов с помощью ЭМ займет многие месяцы.


Разноцветные дрожжи

Сравнение флюоресцентной и электронной микроскопии. Слева — белок Vps4, находящийся на эндосомах живых дрожжей, помечен при помощи GFP. Эндосомы видны как зеленые точки, контуры клеток помечены пунктиром. Справа — эндосомы (Э) дрожжей под электронным микроскопом. Рядом видны рибосомы (черные точки), вакуоль (В). Хорошо видна мембрана эндосом (М) и крошечные внутренние везикулы (ВВ). Фото с изменениями из статьи M. A. Y Adell et al., 2017. Recruitment dynamics of ESCRT-III and Vps4 to endosomes and implications for reverse membrane budding


Чтобы улучшить эту ситуацию, мы решили прибегнуть к распространенному способу — параллелизации экспериментов. Почему бы не объединить множество штаммов дрожжей, которые мы хотим изучить, в один образец, фиксировать, резать и готовить его для ЭМ, а потом, перед тем как собирать данные, разобраться, какая клетка к какому штамму принадлежит? Для этого мы придумали метод под названием MultiCLEM, который решает задачу параллелизации экспериментов для электронной микроскопии. Перед приготовлением образца для ЭМ мы выращиваем все штаммы дрожжей, которые хотим потом объединить, по отдельности, метим каждый штамм своей собственной комбинацией флюоресцентных красителей, связывающихся с клеточной стенкой, а потом смешиваем все помеченные штаммы вместе. Теперь на своей клеточной стенке каждая клетка несет флюоресцентный «штрихкод», показывающий ее принадлежность к определенному штамму.

Чтобы получить эту микрофотографию (см. верхнее фото), мы использовали три разных красителя — синий, зеленый и красный, — скомбинированные всеми возможными способами. Для человеческого глаза эти комбинации выглядят как синий, зеленый, красный (каждый цвет по-отдельности), циановый (синий + зеленый), фиолетовый (синий + красный), желтый (зеленый + красный) и белый (все три цвета вместе). Чем больше разных красителей, тем больше возможных комбинаций («штрихкодов») и тем больше штаммов дрожжей можно объединить в один образец. Максимальное количество, которого нам удалось добиться, — это 5 красителей, дающих 31 «штрихкод». В плане комбинирования разных цветов наш метод напоминает известный метод Брэйнбоу (Brainbow), см. картинку дня Разноцветные нейроны.

Чтобы считать «штрихкоды», мы берем образец, приготовленный для ЭМ, и вставляем его во флюресцентный микроскоп. Так и получается красивая картинка. Затем нужно получить изображение той же области под ЭМ с небольшим увеличением и совместить обе картинки. Так для каждой клетки, видимой на ЭМ, мы получаем ее флюоресцентный «штрихкод». Изучение одних и тех же образцов под разными микроскопами с совмещением данных называется коррелятивной микроскопией (CLEM) и применяется сегодня всё чаще и чаще. Для CLEM часто приходится модифицировать протоколы приготовления образцов. В данном случае мы использовали протокол, который позволяет сохранить флюоресценцию красителей в фиксированном и засушенном конечном образце.

Принцип работы метода CLEM

После того как «штрихкод» считан, образец снова отправляется в ЭМ, чтобы собрать данные под высоким увеличением. Современные электронные микроскопы автоматизированы и могут работать сутками, собирая данные совершенно самостоятельно. Метод MultiCLEM включает в себя набор программ, которые считывают «штрихкоды», помогают настроить электронный микроскоп на автоматический сбор данных и в итоге сортируют полученные данные в соответствии со штаммом дрожжей. Драгоценное время работы на электронном микроскопе тоже используется более эффективно, потому что менять образцы и настраивать микроскоп, чтобы изучить каждую отдельную линию, не нужно.

Например, сфотографировать 100 клеток на ЭМ под большим увеличением занимает примерно 1,5 часа. То есть, чтобы изучить 15 образцов по-отдельности, нужно примерно три рабочих дня (если вы хотите поспать ночью), и менять образец нужно каждые 1,5 часа. Если все 15 образцов объединены в один, то всё равно надо изучить 100 клеток на штамм, что займет 1,5 x 15 = 22 ч чистого времени на микроскопе. Но приходить и менять образец (тоже не очень простое мероприятие из-за вакуума внутри микроскопа) каждые 1,5 ч не надо: достаточно запустить микроскоп утром, заниматься другими делами днем, поспать ночью и на следующее утро забрать готовые данные. Но самая главная экономия, достигнутая нашим методом, — это экономия ручного труда во время фиксирования и резки образца, на каждый из которых уходит 1–2 часа напряженной работы.


Разноцветные дрожжи

Разноцветные дрожжи

Схема работы метода MultiCLEM на примере реального эксперимента с 14 разными образцами дрожжей. Вверху — флюоресцентная и электронные микрофотографии (малое увеличение) одной и той области образца. Данные ФМ и ЭМ объединяются (красные стрелки), чтобы считать «штрихкоды» и найти местоположение клеток. Отдельные клетки автоматически фотографируются ЭМ при большом увеличении и данные сортируются в соответствии со «штрихкодами». Для примера внизу по центру и справа показаны фотографии высокого разрешения митохондрий с нормальной морфологией (небольшой размер, темное содержимое) и с ненормальной (увеличенный размер, светлое содержимое). Микрофотографии даны только для примера и не соответствуют конкретным клеткам, показанным внизу слева. Длина масштабного отрезка: вверху — 20 мкм, внизу — 100 нм. Рисунок © Юрий Быков


В итоге, по нашим расчетам, в рамках одного проекта под электронным микроскопом можно изучить не 10–20 штаммов дрожжей, а 200–300 — без существенного увеличения времени, затраченного на приготовление образцов. Это всё еще далеко до производительности ФМ, но уже позволяет собирать приличную статистику, изучать больше генов и в целом делать исследования более систематически.

Фото из статьи Y. S. Bykov et al., 2019. High-throughput ultrastructure screening using electron microscopy and fluorescent barcoding, длина масштабного отрезка — 10 мкм.

Юрий Быков

20 сентябрь 2019 /
  • Не нравится
  • 0
  • Нравится

Похожие новости

Изготовлена бактерия с синтетическим минимальным геномом

Сотрудники института Крейга Вентера сообщили о новом успехе на пути к созданию искусственных микроорганизмов с заданными свойствами. Используя разработанные ранее методы изготовления синтетических

Половое размножение помогает отбору отделять полезные мутации от вредных

Идея о том, что половое размножение ускоряет адаптацию, неоднократно подтверждалась экспериментально. Кроме того, она имеет весомые теоретические обоснования. До сих пор, однако, ход эволюционных

Дрожалки

На фото — лопастное плодовое тело дрожалки листоватой (Tremella foliacea) на мертвой древесине...

Прозрачный мозг

На картинке — изящная иллюстрация действия метода «опрозрачивания» тканей CLARITY (англ...

Эволюционные последствия генных дупликаций удалось оценить количественно

Дупликация генов с последующим разделением функций между копиями (паралогами) — один из главных способов появления новых признаков. Канадские генетики изучили влияние 56 генных дупликаций,

Экстракт из старых сородичей ускоряет старение

Одной из причин старения многие специалисты считают накопление с возрастом молекулярных «повреждений» той или иной природы. Для проверки этой гипотезы американские и корейские биохимики провели
Комментарии

НАПИСАТЬ КОММЕНТАРИЙ

Ваше Имя:
Ваш E-Mail:
Код:
Кликните на изображение чтобы обновить код, если он неразборчив
Введите код:
Популярные новости
Почему одни нации богатые, а другие — бедные?Люди могут отращивать хрящи, как саламандрыПочему мы стареем? Новая теория ученыхРоссийский аппарат к Луне стартует не раньше 2026 годаОхотник за сокровищами нашел редчайший доисторический кладЧто происходит с океанами Земли?NASA получило новые снимки Большого красного пятна ЮпитераОбманщики чередуют ложь с правдой, чтобы им продолжали верить